FWF - Phosphatidsäure Biosynthese - Biosynthese der Phosphatidsäure in Hefe

In Eukaryonten gibt es zwei nach ihren Ausgangssubstraten benannte Wege der de-novo-Synthese von Phosphatidsäure (PtdOH): a) den Glycerin-3-phosphat- (Gro3P), und b) den Dihydroxyacetonphosphat- (GrnP) Weg. Die Umsetzung von Gro3P zu PtdOH erfolgt durch zwei Acylierungsschritte, während an der PtdOH Biosynthese über den GrnP Weg noch ein weiteres Enzym beteiligt ist, welches das Zwischenprodukt 1-Acyl-GrnP zu 1-Acyl-Gro3P reduziert. In allen eukaryotischen Zellen kommen Enzyme, die an der Bildung von PtdOH beteiligt sind, in mehrfacher Ausführung vor. Dies gilt auch für die Hefe Saccharomyces cerevisiae, welche als Modell für das hier vorgestellte Projekt dienen wird. Bisher wurden in der Hefe bereits einige Enzyme, die die Hauptaktivitäten im Prozess der PtdOH Bildung aufweisen, auf molekularer Ebene identifiziert. Enzymatische Messungen deuten darauf hin, dass an diesem Prozess noch weitere nicht identifizierte und charakterisierte Enzyme beteiligt sind. Dieses Projekt hat zum Ziel diese Redundanz der Enzyme zu erklären. Folgende Fragen gilt es dafür zu beantworten: a) Gibt es ein bevorzugtes Zusammenspiel von einzelnen an der Bildung von PtdOH beteiligten Enzyme? b) Führt ein bevorzugtes Zusammenspiel von Enzymen zur Bildung von so genannten PtdOH "Pools", die weiter in spezifische Stoffwechselwege fließen? Und c) Wie ist der Vorgang der PtdOH Biosynthese reguliert? Um den komplexen Vorgang der PtdOH Biosynthese zu verstehen ist es notwenig alle an diesem Prozess beteiligten Proteine zu kennen. Daher werden verschiedene "Screening" Methoden und Bioinformatik, sowie molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Methoden eingesetzt, um diese noch unbekannten Proteine zu identifizieren und zu charakterisieren. Um das Zusammenspiel der Proteine (Organelle) während der PtdOH Bildung zu untersuchen, wird die subzelluläre Verteilung der Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie (Markierungstechnik) und Zellfraktionierungen (Western Blot Analysen und enzymatische Messungen) bestimmt werden. Untersuchungen der Wachstumsphänotypen verschiedener Mutanten, die Defekte in der PtdOH Synthese aufweisen, und Lipidprofil-Analysen der Zellorganelle dieser Mutanten werden Hinweise liefern, ob verschiedene PtdOH-Pools für die Synthese spezifischer Glycerolipide gebildet werden könnten. Resultate aus DNA Microarray Experimenten, bei welchen Genexpressionsprofile von Mutanten mit Defekten in der PtdOH Biosynthese untersucht werden, werden ebenfalls zeigen ob es durch ein bevorzugtes Zusammenspiel von Enzymen zur Bildung spezifischer PtdOH-Pools kommt. Weiters will dieses Projekt auch regulatorische Aspekte der PtdOH Biosynthese beleuchten, die mittels molekularbiologischer Methoden im Detail untersucht werden. Zusammengefasst, die mit dieser Studie über die PtdOH Biosynthese gewonnenen Erkenntnisse werden zu einem Modell führen, welches wichtige Informationen für ähnlichen Studien in höheren eukaryotischen Systeme enthalten wird.