FWF - Flippase - Charakterisierung des Flippasemechanismus von Rhodopsin

  • Ploier-Brandauer, Birgit (Teilnehmer (Co-Investigator))

Projekt: Foschungsprojekt

Projektdetails

Beschreibung

Rhodopsin ist eines der Netzpigmente von Photorezeptorzellen der Netzhaut und ist für die ersten Prozesse nach der Wahrnehmung von Licht zuständig. Es besteht aus dem Apoprotein Opsin, einem TransmembranProtein mit mehreren Transmembrandomänen und dem reversibel gebundenen Cofaktor Retinal. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass Rhodopsin eine ATP - unabhängige Phospholipid-Flippase ist, die sehr schnell Phospholipide über eine Membran-Doppelschicht transportieren kann. Diese Entdeckung lieferte die molekulare Erklärung für schon früher gemachte Beobachtungen des bidirektionalen, ATP - unabhängigen Phospholipid-Flip-Flops in Photorezeptor-Diskmembranen und führte zu einer weiteren anerkannten Funktion von Rhodopsin neben seiner bekannten Funktion als Phototransduktor. Der Transport von Lipiden innerhalb der Netzhaut ist entscheidend für das Sehvermögen. Retinoide müssen sich schnell zwischen Photorezeptorzellen der Netzhaut und Epithelzellen bewegen, um Rhodopsin nach der Photoaktivierung zu regenerieren. Defekte im Lipidtransport können zu Retinopathien führen. Ein Beispiel ist die Stargardt-Makula-Dystrophie, die durch die Unfähigkeit verursacht wird, ein Retinoid-Phospholipid-Addukt über Photorezeptor-Discs zu transportieren. Bidirektionaler Flip-flop, mittlerweile bekannt durch Rhodopsin katalysiert, löst das Problem der Expansion einer Phospholipid-Monoschicht auf Kosten der anderen, hervorgerufen durch die unidirektionale Bewegung der Lipide durch die zwei ATP-abhängigen unidirektionalen Flippasen ABCA4 (Quazi et al., 2012 ; Weng et al, 1999) und Atp8a2 (Coleman et al., 2009). Obwohl Rhodopsin ein ausführlich untersuchtes Protein ist, ist bis dato kaum etwas über seine strukturellen oder dynamischen Funktionen bekannt, die zum flip-flop von Phospholipiden führen. Das hier vorgestellte Projekt konzentriert sich auf die Identifikation von strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Transmembrandomänen Rhodopsins, die für die Funktion als Flippase erforderlich sind. Wir vermuten, dass der Lipidtransport ermöglicht wird durch spezielle Strukturelemente im Transmembran-Helixbündel von Rhodopsin und durch dynamische Bewegungen der Transmembran-Helices. Um diese Hypothese zu testen, werden wir die Wirkung des Austausches von spezifischen Aminosäuren innerhalb des Transmembran-Helixbündels untersuchen, insbesondere derjenigen, die sehr nah zu Membranlipiden stehen. Die mutagenisierten Rhodopsin- Varianten werden in COS7- Zellkulturen exprimiert und nach Affinitätsaufreinigung charakterisiert. Die Flippase Aktivität wird mittels eines gut etablierten Fluoreszenz-Ansatzes mit 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD)-markierten Lipiden untersucht werden, und deren Orientierung in der Membran wird mit dem impermeablen Reduktionsmittel Dithionit getestet werden. Darüber hinaus werden die fluoreszenzbasierten Daten durch die Etablierung eines neuen Flippase-Assays unter Verwendung von natürlichen Phospholipiden ergänzt werden.
StatusAbschlussdatum
Tatsächlicher Beginn/ -es Ende24/11/1423/05/17

Fingerprint

Erkunden Sie die Forschungsthemen, die von diesem Projekt angesprochen werden. Diese Bezeichnungen werden den ihnen zugrunde liegenden Bewilligungen/Fördermitteln entsprechend generiert. Zusammen bilden sie einen einzigartigen Fingerprint.