FWF - Aldo-Keto Reduktasen - Aldo-Keto Reduktasen als Biokatalysatoren

Projekt: Foschungsprojekt

Projektdetails

Beschreibung

Aldo-Keto Reduktasen (AKRs) bilden eine Superfamilie von hauptsächlich NAD(P)-abhängigen Oxidoreduktasen.
Eine charakteristische Eigenschaft vieler AKRs ist ihr außerordentlich breites Substratspektrum, welches in in-vitro
Aktivitätsstudien gefunden wird. Diese breite Substratakzeptanz ist im Hinblick auf die Produktion chiraler
Alkohole ein großer Vorteil und bietet einen guten Anknüpfungspunkt für die Verwendung von AKRs in der
Biokatalyse. Aber welche AKR ist für eine bestimmte Biotransfomation gegeignet? Antworten auf diese Frage
könnten von einem guten Verständnis der molekularen Basis von Substratspezifitäten in den AKRs kommen und
sind relevant hinsichtlich Grundlagenforschung sowie industrieller Anwendbarkeit der AKRs. In diesem Projekt
schlagen wir eine Studie der Keton-Substratspezifität sowie der stereochemischen Selektivität der Ketonreduktion
der Enzyme Xylose Reduktase aus Candida tenuis (CtXR) und Glycerol Dehydrogenase aus Saccharomyces
cerevisiae (Gcy1) vor. Als Basis unserer Untersuchungen werden die bestehenden Kristallstrukturen dieser Enzyme
dienen. Ein Ziel des eingereichten Projekts ist die Erweiterung des Spektrums stereoselektiv umgesetzter Ketone
von CtXR durch Protein Engineering, auf Basis der Zusammenhänge von Struktur und Substratspezifitäten
ausgewählter AKRs.
Während CtXR keine C-C Doppelbindungs-Reduktaseaktivität besitzt, akzeptieren einige wenige AKRs sowie
kurzkettige Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs), Enoate als Substrat. Anhand des Beispiels dieser verwandten
Enzyme wollen wir das aktive Zentrum von CtXR remodellieren um C-C Doppelbindungs-Reduktaseaktivität zu
implementieren. Für diese spezielle Aktivität in der AKR Familie 1D ist eine His?Glu Punktmutation in der
katalytischen Tetrade der AKRs verantwortlich. In einer His113Glu CtXR Mutante haben wir das aktive Zentrum
der AKR 1D Enzyme nachgeahmt. Ebenso haben wir eine SDR-Typ katalytische Triade in CtXR durch eine
Tyr51Phe Mutation realisiert. Ziel unserer Arbeit ist die Untersuchung der beiden Mutanten auf C-C
Doppelbindungs-Reduktaseaktivität.
Aldo-Keto Reduktasen und andere Reduktasen, können in ganzen Zellen oder als isolierte Biokatalysatoren für die
Reduktion von Ketonen verwendet werden. In beiden Fällen muß das Coenzym (NADH oder NAD(P)H) in
substöchiometrischen Mengen vorliegen, und muß während der Reaktion rezykliert werden. Bäckerhefekatalysierte
Reduktionen haben den Vorteil, daß der Bedarf von NAD(P)H durch den Metabolismus eines Cosubstrates
gedeckt wird. Leider sind Ganzzellreduktionen oft durch niedrige Stereoselektivitäten gekennzeichnet,
welche auf das Vorhandensein von multiplen NADPH-abhängigen Reduktasen mit divergenten enantio- und
diastereomeren Bevorzugungen zurückzuführen sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden stellen wir eine
integrierte Prozessentwicklung mit den Komponenten (i) Struktur-basiertes Enzymengineering, (ii) Zellengineering
und (iii) Prozessengineering vor.
StatusAbschlussdatum
Tatsächlicher Beginn/ -es Ende1/01/0831/12/10